"Die Mistel in der Tumortherapie - Grundlagenforschung und Klinik"
"Mistletoe in Tumor Therapy - Basic Research and Clinical Practice"
Zytotoxische Effekte von Mistellektinen und einem Mistelpräparat auf menschliche natürliche Killerzellen in vitro
Cytotoxic Effects of Mistletoe Lectins and a Mistletoe Preparation on Human Natural Killer Cells in vitro
Es ist seit langem bekannt, dass Mistelextrakte und Mistellektine (ML) auf humane Lymphozyten in vitro schon bei geringen Konzentrationen, bedingt durch die Auslösung des programmierten Zelltods (Apoptose), zytotoxisch wirken. Bisher konnten jedoch nur wenige Unterschiede in der Sensibilität einzelner Lymphozyten-Subpopulationen nachgewiesen werden. Daher wurde das in vitro-Verhalten isolierter menschlicher Lymphozyten in Gegenwart von ML I-III und des Mistelextrakts Helixor®M (HM) näher untersucht. Dabei konnte mittels durchflusszytometrischer Bestimmung des DNA-Gehalts die zeit- und konzentrationsabhängige Induktion einer Apoptose in den Zellen bestätigt werden. Die Verwendung von Mistellektin-Mischungen oder die Zumischung einzelner Mistellektine zum Mistelpräparat führte zu keinen synergistischen oder antagonistischen Effekten. Bei der Analyse der Lymphozyten-Subsets konnte nach 72 Std. schon bei ML-Konzentrationen von 1 ng/ml in der Reihenfolge ML III > ML II > ML I eine deutliche selektive Abnahme des NK-Zellanteils (CD16+ / CD56+ CD3-) in der Zellkultur beobachtet werden. Das Mistelpräparat hatte bei einer Konzentration von 100 µg/ml eine vergleichbare Wirkung. Der zytotoxische Effekt war bereits nach 24 Std. messbar (50%ige Reduktion des NK-Zellanteils bei 23 ng/ml (ML I), 6 ng/ml (ML II) bzw. 3-6 ng/ml (ML III)). Ein Vergleich der ML- und HM-Zytotoxizität für NK-Zellen in der Lymphozyten-Kultur mit der entsprechenden Wirkung in einer Vollblutkultur ergab deutliche Unterschiede zwischen beiden Systemen. Die ML I-Wirkung war im Vollblut signifikant höher. Die Veränderungen in der Zytotoxizität von ML II und ML III beim Übergang in das komplexere System der Vollblutkultur waren in Abhängigkeit vom Blutspender uneinheitlich. Für HM ergab sich dagegen eine signifikante Verringerung des präferenziellen Killings in der Vollblutkultur, obwohl dessen zytotoxische Wirkung an die darin enthaltenen Lektine gebunden war (vollständige Hemmbarkeit der Zytotoxizität des Präparates durch anti-MLI-Serum in beiden Kulturen). Die beschriebenen Resultate zeigen, dass eine Bestimmung zytotoxischer Grenzkonzentrationen von Mistellektinen und Mistelextrakten anhand der Gesamtlymphozyten für Untersuchungen zur in vitro-Modulation der NK-Zellaktivität ungeeignet sind, da auf diese Weise suppressorische Effekte durch ein nicht berücksichtigtes präferenzielles Abtöten der Effektorzellen vorgetäuscht werden könnten. Die deutlichen Unterschiede zwischen Lymphozyten- und Vollblutkultur belegen, dass die Ergebnisse von in vitro-Untersuchungen erheblich vom jeweils verwendeten experimentellen Setting abhängig und nur in begrenztem Umfang auf die in vivo-Situation übertragbar sind. Ferner verdeutlichen die gezeigten Abweichungen des Präparats vom Verhalten der isolierten Substanzen, dass die Mistellektine innerhalb des Inhaltsstoffgemisches von Mistelextrakten im Vergleich zur isolierten Form veränderte Eigenschaften haben können.
Schlüsselwörter: Apoptose, präferenzielles Killing, Mistellektine, Lymphozyten-Subpopulationen, NK-Zellen, PBMC, Vollblutkultur
Cytotoxic effects of mistletoe preparations and mistletoe lectins (ML) at low concentrations on human lymphocytes, cultivated in vitro, are well known. It was demonstrated that these effects mainly depend on the induction of programmed cell death (apoptosis), but up to now, only a few differences in the susceptibility of lymphocyte subpopulations have been shown. Therefore, the behaviour of isolated human blood lymphocytes, cultured in vitro with ML I-III and the commercial available mistletoe extract Helixor® M (HM), was investigated. The induction of apoptosis, depending on incubation time and concentration, could be confirmed by use of flow cytometrical estimation of DNA content. Using ML mixtures or adding ML to HM prior to the incubation did not result in synergistic or antagonistic effects. Considering the lymphocyte subsets, a clear and selective reduction of the portion of natural killer cells (CD16+ / CD56+ CD3-) could be observed after a 72 h incubation period with ML I-III at 1 ng/ml. The ranking of this preferential NK cell killing was as follows: ML III > ML II > ML I. The same effects were observed with HM at a concentration of 100µg/ml. The preferential NK cell killing by the ML was detected already after 24 h of cultivation (50%-reduction of the NK cell portion at 23 ng/ml (ML I), 6 ng/ml (ML II) or 4,5 ng/ml (ML III)). Great differences in cytotoxicity of HM and the ML for NK cells could be found in whole blood cell cultures as compared to lymphocyte cultures. In the former, the effectiveness of ML I to decrease the NK cell numbers was significanty higher. The cytotoxicity of ML II and ML III in the two cell cultures showed interindividual differences. In the case of HM, a significant decrease of effectiveness could be observed in the whole blood cell culture. Despite of that, the effects of HM were related to the ML present in the extract, as the HM cytotoxicity was entirely inhibited by an anti-ML I-serum in both cell cultures. These results indicate that the estimation of the borderline cytotoxicity of ML or mistletoe extracts by use of total lymphocytes may not be suitable for investigations on the NK cell activity, as a preferential killing of the effector cells might not be adequately recognized, and thus misinterpreted as suppressive effects. The observed differences in the results from whole blood cell culture and from isolated lymphocytes demonstrate the large dependence of in vitro results upon the experimental setting and the limited negotiability to the in vivo situation. Furthermore, the different effects of the isolated ML and the mistletoe extract used in our experiments show that the activity of ML may be considerably influenced by the special composition of a mistletoe extract.
Keywords: Apoptosis, preferential killing, mistletoe lectins, lymphocyte subpopulations, NK cells, PBMC, whole blood cell culture