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U. Pfüller, U. Mengs, T. Schwarz, K. Witthohn und K. Pfüller
Natürliche Mistellektine und das rekombinante Mistellektin im Vergleich - Biochemische und biologische Eigenschaften
Native and Recombinant Mistletoe Lectins - Comparison of Biochemical and Biological Properties
Die Europäische Mistel (Viscum album L.) enthält drei Gruppen von glykosylierten Isolektinen des RIP II-Typs, die Mistellektine I (ML I), ML II und ML III. Diese Lektine erkennen Zucker und Glykokonjugate, die Galaktose oder N-Acetyl-galaktosamingruppen enthalten. In vitro- und in vivo- Untersuchungen bestätigen, dass die RIP II-Lektine eine wesentliche Rolle für die biologische Aktivität der Mistelextrakte und Mistelpräparate, die in der adjuvanten Krebstherapie verbreitet eingesetzt werden, spielen.
Aufgrund der herausragenden zytotoxischen und immunmodulierenden Eigenschaften der Mistellektine wurde durch Klonierung des Mistellektin-Gens von Viscum album ein nichtglykosyliertes rekombinantes Mistellektin (rML) hergestellt. Es ist bekannt, dass die Glykosylierung außerordentlichen Einfluss nehmen kann auf die Eigenschaften von natürlichen bzw. rekombinanten Proteinen. Das rekombinante Mistellektin zeigt qualitativ vergleichbare Zuckerbindungseigenschaften wie das Mistellektin I. Deutliche Unterschiede werden jedoch in der Kinetik der Assoziations- und Dissoziationsphase der Interaktion der Lektine mit Glykokonjugaten beobachtet. Die Surface Plasmon Resonance Spektroskopie in Verbindung mit der BIAcore-Technik gestattet die Echtzeiterfassung der Assoziations- und Dissoziationsgleichgewichte von Kohlenhydrat-Lektin-Wechselwirkungen.
Mit dieser Methode lassen sich Unterschiede in der Kohlenhydraterkennung der isolierten ML I/II/III- B-Ketten und der B-Kette des rekombinanten Mistellektins erkennen. Aus den Ergebnissen schließen wir, dass Art und Umfang der Glykosylierung der Mistellektine im wesentlichen auf die Stabilität, das Selbstassoziations-Verhalten und auf nichtspezifische Bindungen an Biomakromoleküle sowie die Löslichkeit Einfluss nehmen. Diese Resultate stehen in Einklang mit Befunden über eine weitgehende Identität zwischen rML und dem natürlichen ML I hinsichtlich der in vitro beobachteten zytotoxischen Eigenschaften und der Fähigkeit, Zytokine aus immunkompetenten Zellen freizusetzen.
Schlüsselwörter: Viscum album L., Mistellektine ML I, ML II, ML III, rekombinantes Mistellektin rMl; Lektin-Untereinheiten, Kohlenhydratbindung, Biochemische Interaktionsanalyse (BIA)
European Mistletoe (Viscum album L.) contains three groups of glycosylated isolectins of the RIP II typ, mistletoe lectin I ( ML I) , ML II and ML III, which recognize sugars and glycoconjugates containing galactose and/or N-acetyl-galactosamine groups. In vitro and in vivo assays confirm that the RIP II lectins play an important role as biologically active principles in mistletoe extracts, widely used in adjuvant cancer therapy. Non-glycosylated recombinant mistletoe lectin (rML) was prepared by cloning of the ML gene of Viscum album because of the outstanding cytotoxic and immunomodulating activities of mistletoe lectins. The native and recombinant forms generally differ with respect to glycosylation. To identify the role of glycosylation for lectin activity, sugar binding of native and recombinant forms of ML were compared quantitatively. Detailed information on carbohydrate-binding specifities of mistletoe lectins is a prerequisite to understand interactions with possible receptors and target molecules on cell membranes. The function of the glycan part of mistletoe lectins is still not clear. The sugar binding specificity of recombinant ML and native glycoforms was investigated by competitive inhibition experiments using galactose (gal), N-acetyl-galactosamine (galNAc), and their derivatives like complex sugars and glycoconjugates as inhibitors, including hemagglutination inhibition assays, precipitation inhibition assays, fluorimetric assays, affinity chromatographic methods and surface plasmon resonance spectroscopy (SPR, Biochemical Interaction Analysis, BIA). The recombinant mistletoe lectin rML shows qualitatively comparable sugar bind-ing properties like ML I, but pronounced differences in the kinetics of association and dissociation phases as confirmed by BIA results. The recombinant B-chain showed a more dominant galNAc-specificity than the native ML I B-chain. Some differences in carbohydrate recognition by the B chains become apparent only by use of special assay methods. We conclude that glycosylation of mistletoe lectins is mainly influencing stability, self-association, non-specific binding and solubility. But only minor differences were observed in distinction of carbohydrate targets between native glycoforms and rML. In accordance with these results rML and native ML I show in vitro and in vivo related cytotoxic properties and abilities to release cytokines from immune competent cells.
Key words: Viscum album L., mistletoe lectins ML I, ML II, ML III, recombinant mistletoe lectin (rMl), lectin subunits, carbohydrate binding, Biochemical Interaction Analysis (BIA)
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